咱们来聊聊WB电泳搞砸了该咋办，总共15个坑位我给大家一次捋清楚。首先，条带到处弥散或者出现鬼影，这都是因为蛋白酶还在干活，你可以去翻翻《Methods Mol Biol》那本书，基本上每页都能看见这两个词，吓得人够呛。第二点要注意温度和酸的影响，天冬氨酸-脯氨酸肽键特别怕热和酸，稍微有点高温或者酸性环境它就会断开，导致蛋白散架。想减轻伤害，可以试着把变性温度从95度降到75度，时间也减到5分钟；不过有些蛋白比较硬气，哪怕在100度下熬上几小时也没事，这个得看情况调整。 第三点是55到65 kDa区间出现的“毛线团”，多半是角蛋白在捣乱。平时你刷刷牙、挠挠头，口腔黏膜、皮屑、睫毛这些东西都容易带进样品里。解决办法就是戴上手套、帽子和口罩先把物理隔绝做好；实在不放心的话，在样品上样前用蛋白酶抑制剂 cocktail再处理一遍。 第四点得警惕一次性塑料器皿里的隐形毒素。阳离子消毒剂还有润滑剂可能残留在吸头或者离心管里，你可以先用纯水冲一遍，再用甲醇或者DMSO涮两遍把这些干扰物去掉。尿素溶液里的氰酸铵也不能忽视，它挥发后会在胶上留下鬼影，操作的时候尽量减少暴露时间。 第五点是还原剂没发挥好作用导致蛋白反折。高温变性后如果直接上样，还原剂可能会被部分氧化，保护不了半胱氨酸了。这时候可以把样品冷却到60度左右补加点碘乙酰胺室温孵育5分钟再进胶，条带马上就能变清晰。 最后说说PBS洗细胞的问题。PBS里的盐离子会让蛋白压缩变形变得模糊不清。上样前最好换个低盐缓冲液或者干脆用纯水洗两遍细胞再离心浓缩一下，这样就能把背景降到最低。 看了这么多是不是心里发慌？其实科研本来就是个排雷游戏——以前踩过的坑以后都是成功的经验了。祝你下次电泳顺利出图！