你在细胞培养的时候，最怕碰到啥？细菌、真菌、霉菌、支原体、黑胶虫这些家伙藏在培养箱里，等你一不留神就出来捣乱。这次先把最常见的五种污染讲清楚，给你点“救场”的方法。先来说说细菌污染，培养液里经常会出现小黑点，还能闻到“臭鸡蛋”味儿，液体也变得发黄浑浊。这时候赶紧往培养基里加点抗生素吧。 然后是真菌污染，早期看起来还挺清亮的，显微镜下能看到丝状或者珊瑚状的菌丝。 一旦发现真菌，别犹豫直接把瓶子扔了，赶紧把整个培养环境彻底消毒一遍。接着是霉菌污染，它在清亮的培养液里漂浮着絮状物。 处理方法和真菌差不多。 支原体污染比较狡猾，培养液不浑浊但细胞状态变差了。 只要不是那种珍贵的细胞系直接丢掉省事。 最后是黑胶虫，它没啥毒性，400倍镜下才看得到会游动的小黑点。 提高种板密度、及时处理就能降低损失。 下面说说传代这事儿吧。传代看似简单，其实能决定细胞的“寿命”。 贴壁细胞和悬浮细胞的操作方法不一样。 用胰酶消化的时候先试试低浓度（0.05%）的，如果难消化可以加点EDTA升到0.25%。 细胞密度超过80%时要用分步消化法：先用低浓度把边缘弄圆，再用高浓度收尾。 消化时间宁短勿长。 新细胞第一次传代的时候要摸索一下最佳时间：每一分钟看一次显微镜，记下细胞变圆的时刻。 下一次就直接按照这个时间操作就行了。 悬浮细胞要是密度太高容易抱团形成大团块。 这时候用筛子过滤或者静置一会儿让大团块沉底再吸掉上清液就好了。 千万别使劲吹打。 细胞出现空泡不一定是坏事。 少数几个空泡可能是状态有点下滑；如果大多数细胞都有空泡而且体积很大，说明细胞老化了。 换一批血清或者减少传代次数能稍微改善一下情况。 如果已经传到了很多代就直接换一批新的吧。 生长放缓通常有六种原因：消化过度、传代太密、营养失衡、代际传递、状态老化还有没被发现的污染。 一条一条排查才能解决问题。 最合适的传代时间是汇合度在70-80%的时候。 等细胞长太老了再去做操作会出现分化、形态变差甚至漂片死亡的情况。 提前记下来自己细胞的临界点吧。 复苏与冻存也是个技术活。 复苏的时候要把冻存管放在37℃水浴里快速解冻。 然后离心洗掉上清液重新加培养基放回孵箱里。 第二天再换一次液把残留的DMSO清除干净。 冻存的话要先把细胞用PBS洗两遍去除代谢废物。 再用胰酶消化、离心、重悬在冻存液中（DMSO不超过10%）。 可以选择三种不同的降温程序来做：一种是缓慢降温后直接扔液氮里；一种是先放4℃再放–20℃、最后放–80℃过夜；还有一种是直接放进程序降温盒里降到–80℃待几个小时再扔液氮里。 不管用哪种程序都要记清楚日期和降温曲线。